葡萄糖-6-磷酸脫氫酶檢測試劑概述與審評思考
- 2022-05-20 13:07
- 作者：焦童
- 來源：?中國食品藥品網
葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PD）廣泛存在于各種生物體內，它是糖酵解磷酸戊糖旁路中的一個關鍵酶和限速酶，其主要的功能是產生還原型輔酶Ⅱ（NADPH）。NADPH對于維持細胞的正常生理功能和形態極為重要。當機體缺乏NADPH時，紅細胞極易受到氧化損傷，從而引起溶血性疾病。
蠶豆病是G6PD缺乏癥的一個類型，表現為患者在進食蠶豆或蠶豆制品后引起急性血管內溶血性貧血，臨床表現為皮膚、鞏膜黃染，有些病例會出現血紅蛋白尿，有些則有肝腫大現象。蠶豆病多發于幼兒及兒童，以男性多見。G6PD基因突變是導致G6PD缺乏癥的主要原因，G6PD基因定位于Xq28，由13個外顯子和12個內含子組成，編碼515個氨基酸。G6PD缺乏癥屬于X連鎖不完全顯性遺傳，對其進行早期診斷和預防十分重要。本文介紹G6PD相關產品檢測方法與性能評估要求，并概述對我國相關檢測試劑的審評思考。
常用檢測方法
目前，G6PD常用檢測方法包括酶學和基因檢測兩大類。
其中，酶學檢測法包括葡萄糖-6-磷酸底物法、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）/6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶（6PGD）比值法、高鐵血紅蛋白還原法、熒光斑點法等；常規基因檢測法包括等位基因特異性擴增(ARMS)、等位基因寡核苷酸探針雜交(ASO)、錯配堿基聚合酶鏈反應/限制性內切酶圖譜分析等。
已批準相關產品概況
目前，已獲批上市的G6PD相關檢測產品通常采用檢測G6PD基因突變情況的基因檢測法以及檢測G6PD含量及活性的酶學檢測法。檢測樣本涵蓋血清、全血、新生兒足跟血濾紙干血片等多種類型。
對于采用基因檢測方法的G6PD檢測產品，其方法學主要包括熒光PCR熔解曲線法、PCR-反向點雜交法等，用于體外定性檢測人外周血基因組DNA中的中國人群常見的G6PD基因突變。
G6PD酶活性檢測方法具有操作便捷、價格低廉等諸多優點，目前廣泛應用于臨床診斷領域。已上市酶學檢測產品的方法學多為葡萄糖-6-磷酸底物法。G6PD能夠在氧化型輔酶Ⅱ（NADP）存在條件下，催化6-磷酸葡萄糖生成6-磷酸葡萄糖醛酸和NADPH。通過在340nm處測定NADPH的生成速率，可檢測G6PD的活性。此外，還有比值法檢測試劑，其中，試劑A液和B液分別在不同通道內采用速率法檢測紅細胞中G6PD與6PGD的活性，反應原理均為催化其相應的底物反應，并將NADP還原為NADPH，通過監測340nm處吸光度上升的速率來計算兩者的活性，再通過計算兩者的比值，進而判斷人體是否缺乏G6PD。
相關檢測試劑國際監管概況
2016年，WHO發布《葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性檢測體外診斷試劑指導原則》，該指南根據性別和G6PD活性將人群劃分為G6PD正常、缺陷和中介（詳見表）。該指南對分析性能評估的要求概述如下。
表1 ?不同葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性人群劃分
適用樣本類型
為證明樣本類型的等效性，應至少選用25個G6PD正常樣本、25個中介樣本和25個缺陷樣本。
此外，為證明聲稱抗凝劑的等效性，應至少選用25個G6PD正常樣本、25個中介樣本和25個缺陷樣本。
樣本收集、儲存和運輸
在樣本穩定性研究中，研究者應考慮到儲存條件（不同溫度下的持續時間、濕度變化、溫度限制、凍融循環），運輸條件（如適用），樣本采集和轉移裝置（包括干血斑濾紙）是否含有抗凝劑、是否可以密封等諸多因素。
精密度
重復性和再現性試驗都應根據預期用途選用至少1個G6PD正常樣本、1個中介樣本和1個缺陷樣本。所選樣本應確保在關鍵決策點附近、具有良好的G6PD活性代表性。必須證明關鍵決策點附近樣本的精密度。每個測試樣本應采用3批試劑，進行5個重復，運行3-5次，選擇3個不同的試驗地點，酶學方法還應選用2個溫度。
分析靈敏度
最低檢出限
選擇至少8個樣本進行最低檢出限研究，每個濃度至少檢測15次。將95%檢出率的最低酶活性作為最低檢出限。所檢測樣本的酶活性應采用合適的生物學參考物質以及合適的參考方法進行校正。
關鍵決策點性能驗證
必須驗證相關試劑區分G6PD活性（如正常、缺陷、中介）的能力。可通過采用含不同比例G6PD正常和缺陷的混合樣本，獲得廣泛的G6PD活性，從而了解決策點（即缺陷/中介/正常）的性能。需要注意的是，應至少測試三對單獨試樣的混合物。
測量范圍和相關性
定量檢測試劑必須采用經合適生物學參考物質以及合適參考方法進行校正的、G6PD活性已知的樣本進行測量范圍研究。對于已知G6PD活性樣本的平行試驗結果，應進行適當的統計分析，還應確定定量與適當參考試驗的相關性程度。
對于報告血紅蛋白濃度或將血紅蛋白濃度標準化作為報告結果一部分的試劑，還必須確定測定血紅蛋白濃度的定量測量范圍和相關程度。
分析特異性
特異性研究必須研究假正?；蚣偃毕萁Y果的可能性，研究可采用自然或人工樣本進行。內源性干擾物質包括總膽固醇，血脂、膽紅素和蛋白質升高樣本，乳酸，乳酸脫氫酶，含銅化合物（如氯化銅、硫酸銅），異常高值（54%-65%）和異常低值（17%-18%），血球壓積，網織紅細胞，白細胞和血小板升高樣本，瘧疾，甲型肝炎，乙型肝炎，丙型肝炎，艾滋病毒，肺炎，傷寒，鐮狀細胞貧血，變異血紅蛋白（A、D、E、S、C），貧血，血紅蛋白病，缺鐵，白血病或其他紅細胞疾病，糖尿病等。外源性干擾物質包括相關藥物，如抗寄生蟲、抗瘧疾、抗逆轉錄病毒和抗結核藥物、普通非處方抗炎藥物（阿司匹林、撲熱息痛、布洛芬），乙醇，咖啡因和某些類固醇（醛固酮相關）。
目前，我國已有G6PD檢測相關產品獲批上市，還有部分產品正處于研發或計劃申報階段。此類產品用于對人體樣本中的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶進行檢測，在臨床上主要用于遺傳性紅細胞G6PD缺乏癥輔助診斷，產品臨床風險較高。
當前，相關企業在產品研發過程中對產品的認識程度不一，在參考品設置、分析性能評估等方面仍存在諸多問題有待解決。因此，有必要對這些共性問題進行總結規范，為申報企業從產品研發、生產至注冊申報階段提供更為全面的指導，為相關產品技術審評提供參考依據。
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(責任編輯：譙英固)
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